1940年H.A.克雷伯斯提出三羧循環學說以來，檸檬酸的發酵機理逐漸被人們所認識。已經證明，糖質原料生成檸檬酸的生化過程中，由糖變成丙酮酸的過程與酒精發酵相同，亦即通過E-M途徑（二磷酸己糖途徑）進行酵解。然后丙酮酸進一步氧化脫羧生成乙酰輔酶A，乙酰輔酶A和丙酮酸羧化所生成的草酰乙酸縮合成為檸檬酸并進入三羧循環途徑。

檸檬酸是代謝過程中的中間產物。在發酵過程中，當微生物體內的烏頭酸水合酶和異檸檬酸脫氫酶活性很低、而檸檬酸合成酶活性很高時，才有利于檸檬酸的大量積累。  

發酵工藝分表面發酵和固體發酵，按不同工藝制備不同原料的培養基，然后進行蒸料。蒸料的目的是將淀粉糊化，并進行滅菌。蒸料時要使物料受熱均勻，蒸汽通暢，邊蒸邊加料，把料加在冒汽的地方，逐層加入。蒸好的物料要揚散攤涼，當溫度降至37℃以下，即可補水接種，裝盤發酵，發酵終點以酸度來決定，定期測定酸度，保證在酸度最高時出料，以免檸檬酸被細菌分解。

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